Lyhyt keskustelu oligonukleotidilääkkeiden ja fosforireagenssien kemiallisesta synteesistä{0}}CTPPA

(Fosforireagenssit-CTPPA:2-Syanoetyyli-N,N,N',N'-tetraisopropyylifosforodiamiditiitti CAS-nro:102691-36-1)

Nukleiinihappolääkkeiden ala on herättänyt paljon huomiota viime vuosina. Nukleiinihappolääkkeiden hyväksyminen ja lanseeraus on kiihtynyt, ja useista tällaisista lääkkeistä, joista voi tulla menestystuotteita, on julkaistu kliinisiä tietoja, jotka kattavat muun muassa sydän- ja verisuoni- ja aineenvaihdunta-, maksasairaudet ja erilaiset harvinaiset sairaudet. Vuoden 2025 ensimmäisellä puoliskolla yhteensä 22 pientä nukleiinihappolääkettä (mukaan lukien jo markkinoilta vedetyt) on hyväksytty markkinointiin maailmanlaajuisesti. Ne koostuvat 13 ASO-lääkkeestä, 7 siRNA-lääkkeestä ja 2 ligandi{7}}pohjaisesta lääkkeestä.

Luokittelussa suurin osuus on ASO-lääkkeillä, joista 13 markkinoitua lääkettä edustaa 59,09 % kokonaismäärästä. Tämän jälkeen tulevat siRNA-lääkkeet, joista 7 markkinoitua lääkettä muodostavat 31,81 %. Käyttöaiheista 17 lääkettä kohdistuu geneettisiin harvinaisiin sairauksiin, 3 keskittyy silmäsairauksiin, 1 sydän- ja verisuonisairauksiin ja 1 hematologisiin onkologisiin komplikaatioihin. Käyttöaiheen jakautuminen esittelee mallin "harvinaisista sairauksista pääpainopisteenä, läpimurtoineen useilla aloilla". On selvää, että pienten nukleiinihappolääkkeiden kliininen käyttö laajenee vähitellen harvinaisten sairauksien ulkopuolelle muille sairausalueille.

Nukleiinihappolääkkeiden lisääntyvän tutkimuksen myötä erilaisten oligonukleotidilääkkeiden laajamittaisesta tuotannosta tulee vähitellen tulevaisuuden trendi, joista kemiallinen synteesi on tärkein menetelmä lyhytketjuisten oligonukleotidien syntetisoinnissa. Yli puolen vuosisadan kehitystyön jälkeen oligonukleotidien kemialliset synteesimenetelmät ovat kehittyneet alkuperäisestä fosfodiesterimenetelmästä fosfotriesterimenetelmään ja fosfiittimenetelmään ja sitten tällä hetkellä kypsään fosforamidiittimenetelmään. Samalla tavalla kuin peptidisynteesi, myös oligonukleotidisynteesi voidaan jakaa toisesta näkökulmasta liuos-faasisynteesiin ja kiinteän{5}}faasisynteesiin. Tässä artikkelissa esitellään yleisimmin käytetyt "fosforireagenssit" ja niiden sovellukset nukleosidimonomeerisynteesissä.

Kuva 1 Fosfitylointireagenssit ja aktivointireagenssit

Oligonukleotidien synteesissä nukleosidimonomeerien valmistus on välttämätön vaihe. Tällä hetkellä on olemassa kahta pääfosfylointireagenssia, joita käytetään laajalti erilaisten nukleosidimonomeerien syntetisoimiseen: toinen on 2-syaanietyyli-N,N-di-isopropyylikloorifosforamidiitti (1) [1]; toinen on bis(di-isopropyyliamino)(2-syaanietoksi)fosfiini (2) (kuva 1) [2]. 2-Syanoetyyli-N,N-di-isopropyylikloorifosforamidiitilla (1) on suurin reaktiivisuus ja se kondensoituu helposti alkoholien kanssa. Sitä vastoin bis(di-isopropyyliamino)(2-syaanietoksi)fosfiini (2) vaatii in situ -aktivoinnin, jota katalysoivat heikosti happamat reagenssit, kuten tetratsoli, ennen kuin se voi kondensoitua alkoholien kanssa (kuva 1). Käytännön näkökulmasta 2-syaanietyyli-N,N-di-isopropyylikloorifosforamidiitti (1) on kalliimpaa kuin bis(di-isopropyyliamino)(2-syaanietoksi)fosfiini (2). Korkean reaktiivisuutensa vuoksi 2-syanoetyyli-N,N-di-isopropyylikloorifosforamidiitti (1) on alttiimpi hajoamiselle, mikä tekee sen käytöstä ja varastoinnista hankalaa. Sillä on myös taipumus lisätä ylimääräisiä epäpuhtauksia reaktion aikana, mikä johtaa vähemmän ihanteelliseen puhtauteen ja saantoon. Siksi bis(di-isopropyyliamino)(2-syaanietoksi)fosfiini (2) on tällä hetkellä yleisemmin käytetty fosfylointireagenssi nukleosidimonomeerien valmistuksessa, ja siitä käytetään usein lyhennettä "fosforireagenssi".

Kuva 2 Tetratsolin-katalysoidun fosfitylaation reaktiomekanismi

"Fosforireagenssien" ja alkoholien välisessä kondensaatioprosessissa lisätään yleensä stökiömetrinen tai substökiömetrinen määrä aktivoivaa reagenssia. Yleisimmin käytettyjä aktivointireagensseja ovat tetratsoli, 4,5-disyaani-imidatsoli ja pyridiniumtrifluoriasetaatti [3,4]. Tällä hetkellä "fosforireagenssien" ja tetratsolin katalysoimien alkoholien välisen kondensaatioreaktion mekanismia on tutkittu perusteellisesti [5-7].

Reaktio etenee seuraavasti: ensin "fosforireagenssi" protonoituu; sitten di-isopropyyliamiini on substituoitu tetratsolilla; myöhemmin tetratsoli korvataan alkoholilla (kuvio 2). Näistä vaiheista di-isopropyyliamiinin korvaaminen tetratsolilla on nopeuden{2}}määrittävä vaihe.

Kolmesta edellä mainitusta aktivointireagenssista tetratsolilla on vahvin happamuus (pKa=4.89) [3], mikä on verrattavissa etikkahapon (pKa=4.74) happamuus. Sitä vastoin 4,5-disyaani-imidatsolilla (pKa=5.20) [3] ja pyridiniumtrifluoriasetaatilla (pKa=5.23) ​​[3] on heikompi happamuus.

Koska nukleosidimonomeerien 5'-hydroksyyliryhmä on tyypillisesti suojattu happo-labiililla 4,4'-dimetoksitrityyliryhmällä (DMT), tetratsolin käyttöön voi liittyä DMT-suojauksen poistamisen sivureaktio. Siksi 4,5-disyaani-imidatsoli (pKa=5.20) ja pyridiniumtrifluoriasetaatti (pKa=5.23) ovat joskus ihanteellisia valintoja.

Lisäksi Koch et ai. raportoi, että kun 4,5-disyaani-imidatsolia käytetään aktivoivana reagenssina, täydellinen konversio voidaan saavuttaa vain 0,7 ekvivalentilla reagenssia. Sitä vastoin yli 1 ekvivalentin käyttö on altis dimeerisivutuotteiden muodostumiselle [4].

"Phosphorus Reagent{0}}CTPPA":n ominaisuudet

"Fosforireagenssi" on väritön tai vaaleankeltainen neste, jolla on suhteellisen korkea kiehumispiste (115 astetta /0,6 Torr). Se on herkkä sekä hapelle että kosteudelle ja pyrkii hajoamaan helposti tyhjötislauksen aikana, mikä tekee tämän tuotteen laajamittaisesta tuotannosta haastavaa. Samaan aikaan fosforireagenssin laadunvalvonta aiheuttaa erityisominaisuuksiensa vuoksi merkittäviä vaikeuksia. Käyttäjille jokaisen käytön jälkeen reagenssi tulee suojata typellä ja säilyttää eksikaattorissa. Tämä käytäntö voi pidentää reagenssin käyttöikää.

Yrityksemme on harjoittanut fosforireagenssien tuotekehitystä ja tuotantoa lähes vuosikymmenen ajan, ja sillä on laaja kokemus tuotteen valmistuksesta ja testauksesta. Tällä hetkellä voimme toimittaa erittäin-puhtaita "fosforireagenssia" kilogramman mittakaavassa. Lisäksi tarjoamme myös vastaavia tuotteita, kuten tetratsolia ja 4,5-disyaani-imidatsolia. Toivotamme ystävät tervetulleiksi ottamaan meihin yhteyttä (taulukko 1).

Taulukko 1 Yrityksemme valmistamat ja myymät asiaankuuluvat tuotteet

Viitteet

[1] Sinha, ND; McManus, J.; Köster, H. Nucleic Acids Research 1984, 12, 4539.

[2] Nielsen, J.; Taagaard, M.; Marugg, JE, et ai. Nucleic Acids Research 1986, 14, 7391.

[3] Sanghvi, YS; Guo, Z.; Pfundheller, HM, et ai. Organic Process Research Development 2000, 4, 175.

[4] Pedersen DS; Rosenbohm C.; Koch T. Synthesis 2002, 802.

[5] Nurminen, EJ; Mattinen, JK; Lönnberg, H. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998, 162.

[6] Berner, S.; Mühlegger, K.; Seliger, H. Nucleic Acids Research 1989, 17, 853.

[7] Dahl, BM; Nielsen, J.; Dahl, O. Nucleic Acids Research 1987, 15, 1729.